Clonación en Agar

En este post, desde AIRAM os traemos información sobre un revolucionario método para la clonación: La Clonación en Agar.

Durante el Neolítico, la primera revolución que transformó la economía humana dio al hombre el control sobre su propio abastecimiento de alimentos. El hombre comenzó a sembrar, cultivar y a mejorar por selección algunas yerbas, raíces y arbustos comestibles.

prehistoriaLa agricultura apareció en diversas culturas que la practicaban de forma independiente: Mesopotamia, América Central y Asia. Dicha aparición pudo deberse a un cambio climático hacia temperaturas más templadas, que permitieron al hombre llevar a cabo asentamientos en aquellos lugares que gozaban de mejor clima. Los primeros cultivos se basaron en granos como el trigo y la cebada que, junto a otros vegetales, constituían la base de la economía.

El hombre del Neolítico practicaba una agricultura primitiva caracterizada por el llamado cultivo de azada o cultivo hortense. Las parcelas eran cultivadas durante varios años hasta ser agotadas, sin llevarse a cabo abonado, ni el barbecho de la misma. Tras el declive de la producción, se despejaba otra parcela y se cultivaba hasta que volvía a agotarse. Cuando toda la tierra cercana al poblado había sido agotada, los habitantes se trasladaban para comenzar de nuevo en otra parte.

El efecto benéfico que produce sobre el crecimiento de las plantas la adición al suelo de elementos minerales, como cenizas de plantas o cal, así como el efecto tóxico que productos como la sal ejercen sobre los mismos cultivos, son aspectos conocidos en la agricultura hace más de 2000 años. Sin embargo, hasta hace 150 años, todavía era materia de controversia científica definir si los elementos minerales cumplían una función de nutriente en el crecimiento de las plantas. A finales del siglo XVIII, De Saussure (1767-1845), introdujo la idea de que algunos elementos podían ser indispensables. Surge así el concepto de elemento esencial para el crecimiento de las plantas.

En la misma época, S. Sprengel en Alemania y J. B. Boussingault en Francia enunciaron, el primero, que un suelo puede ser improductivo desde el punto de vista agrícola por ausencia exclusiva de un elemento esencial. El segundo, por su parte, estudió la relación entre los efectos de fertilizar los suelos, la absorción de nutrientes y el rendimiento de los cultivos.  A partir de la mitad del siglo XIX surgen figuras como J. Sachs, famoso botánico alemán que, en 1880, demostró por primera vez que las plantas podían crecer y desarrollarse en soluciones nutritivas totalmente carentes de suelo, lo que determinaría toda una forma de investigación, aún hoy vigente, en el estudio de los requerimientos de nutrientes: los cultivos hidropónicos.

Destacar también a Justus von Liebig (1803-1873), a quien debemos el establecimiento de la nutrición de las plantas como disciplina científica, gracias a su trabajo de recopilación y armonización de toda la información existente en su época de forma estructurada. Así, a finales del siglo XIX, especialmente en Europa, grandes cantidades de potasa, superfosfato y posteriormente, nitrógeno inorgánico fueron usadas en agricultura y en horticultura para mejorar el crecimiento y la productividad de los cultivos.

En 1838 Schwann y Schleiden lanzaron la teoría denominada de la totipotencia, la cual establece que las células son autosuficientes y en principio son capaces de regenerar una planta completa. Su teoría fue de hecho el núcleo del que nació el cultivo de tejidos y células. Los primeros intentos de la mano de Haberlandt, en 1902, fueron un fracaso. Sin embargo, entre 1907 y 1909, Harrison, Burrows y Carrel tuvieron éxito al cultivar in vitro tejido animal y humano. Aunque algunos investigadores habían conseguido previamente cultivo in vitro de semillas de orquídea, embriones y órganos de plantas, fueron, en 1939, Nobécourt, Gautheret y White los que conseguirían el primer cultivo de tejidos auténtico.

tejidos vegetalesEl cultivo de tejidos vegetales quedó algo rezagado con respecto al cultivo de tejidos animales y humanos, debido al tardío descubrimiento de las hormonas (reguladores) vegetales. El descubrimiento de la auxina IAA, y posteriormente de la sustancia reguladora kinetina constituyo un nuevo estímulo. Desde aquel entonces han tenido lugar enormes avances, al principio en Francia y EEUU y más tarde en otros países. Teniendo en cuenta las profundas implicaciones prácticas que el cultivo de tejidos vegetales tiene en la agronomía, la mejora, etc. El número de investigadores se incrementará con toda probabilidad en el futuro.

Hay muchos tipos de cultivo in Vitro. Tenemos:

– Cultivo de plantas intactas.

– Cultivo de embriones.

– Cultivo de órganos aislados. Por ejemplo, cultivo de meristemos, cultivo de ápices del vástago, cultivo de raíces, cultivo de anteras, etc. Generalmente una porción (de tejido, o un órgano), aislada de una planta, se denomina explanto, y a su cultivo, cultivo de explanaos.

– Cultivo de callo.

– Cultivo de células aisladas.

– Cultivo de protoplastos.

En la preparación de los medios nutritivos usados en cultivo in Vitro, se utilizan diversas sustancias. Se trata de: agua, compuestos orgánicos (azúcares, aminoácidos, vitaminas, auxinas, citokininas, giberelinas, ac. abscísico, etileno), compuestos inorgánicos (macroelementos:: N, P, K, Ca, Mg, S, y microlementos: Fe, Zn, B, Mn, Cu, Co, Ni, Al, Mo, I), y un grupo de sustancias complejas de composición poco definida (Extracto de levadura, leche de coco, extractos vegetales, hidrolizado de caseína, peptona y triptona).

CULTIVO EN AGAR

agarAdemás de estas sustancias, cabe destacar también el uso de agar. Dicho agar es un derivado de un alga marina, que se obtiene en forma de píldora, y que se usa como agente gelificante en la mayor parte de los medios nutritivos. Aunque se trata de un producto natural, se lava y purifica durante su elaboración, de manera que prácticamente no contiene materiales tóxicos. El agar es un polisacárido que se obtiene a partir de algas rojas marinas con una elevada masa molecular, que tiene capacidad para gelificar los medios. La mayoría de microorganismos son incapaces de degradarlo.

El agar disuelto forma un gel que es capaz de retener el agua (cuanto mayor es la concentración del agar, mayor es la fuerza con la que el agua es retenida), y adsorber compuestos. Si la concentración del agar se incrementa, cada vez resulta más difícil para los explantos establecer contacto con el medio, con lo que se limita la absorción de los compuestos.

El tratamiento de un Agar y los métodos utilizados en su purificación dan, básicamente, 4 tipos de Agar:

– Agar técnico.

– Agar bacteriológico tipo americano.

– Agar bacteriológico tipo europeo. Es el más usado para la preparación de medios de cultivo en general. Es el más usado en Europa.

– Agar purificado.

Estos productos pueden ser encontrados en empresas de material de laboratorio como: Panreac, Insulab…

agar1La concentración usual para el agar se sitúa entre 13-20 g/l para medios sólidos y 5-7 g/l para medios semi-sólidos. Si se utiliza una concentración más baja (menos de 5 g/l), el medio nutritivo permanece sin cuajar, sobre todo cuando el pH es bajo. Si la concentración es muy alta (más de 20g/l), el medio nutritivo queda muy sólido, haciendo difícil la inoculación. Si se utiliza una concentración de 13-20 g/l , y el medio no adquiere rigidez, debe corregirse el pH; si el pH es más bajo que 4.5-4.8, el medio  no gelifica adecuadamente.

El crecimiento in Vitro puede ser afectado de forma negativa si la concentración de agar es demasiado elevada.

La mayor parte de los medios nutritivos se esterilizan en autoclave. Este aparato esteriliza por medio de vapor. Siempre que el tiempo de exposición sea suficiente, el vapor a presión puede destruir todos los micro-organismos, en un tiempo de 20 minutos y a una temperatura de 121º C.

El principal problema de la aplicación de esta técnica en el hogar, suele presentarse a la hora de esterilizar tanto el material como la solución nutritiva. Otra dificultad añadida es la necesidad de trabajar en un ambiente lo más aséptico que se pueda.

Un autoclave resulta caro para su uso en el hogar. En este caso, los medios nutritivos se pueden esterilizar durante 30 minutos en una olla a presión. Si son volúmenes grandes se pueden utilizar tiempos de 60-70 minutos.

Para la inoculación del material en los medios de cultivo en laboratorio, se usan las llamadas cámaras de flujo laminar. Son unas cabinas en las que mediante una combinación de luz ultravioleta y un filtro HEPA, que filtra el aire que circula por el sitio de trabajo, se consigue trabajar en un espacio libre de agentes patógenos, que pueden echar por tierra toda nuestra labor en cuestión de segundos. En casa estas condiciones son imposibles de conseguir.

A continuación se detallan los materiales y el método empleados para elaborar el medio en cuestión.

MATERIAL

– Agitador magnético con calefacción.

– Balanza de precisión (0,001-150 g).

– Vaso de precipitado (capacidad: 1000ml).

– Agua bidestilada.

– Agar bacteriológico de tipo europeo  (marca Cultimed).

– Reguladores (Clonex).

– Botes de cristal con tapadera. (capacidad 200 ml).

– Film transparente.

MÉTODO

Se sitúa el vaso de precipitados sobre el agitador. Se añaden 1000 ml de agua bidestilada y se pone a calentar. Se conecta el agitador a velocidad moderada.

Cuando el agua empieza a hervir, se echa el agar poco a poco. La cantidad de agar se sitúa en torno a 13-20 gramos por litro. Dependiendo de lo sólido que se desee el gel resultante.

Se hierve la disolución, a fuego medio, durante 10-15 minutos, con el agitador en marcha.

Transcurrido el tiempo, se desconecta el calentador y se deja enfriar la disolución.

Antes de que dicha disolución empiece a gelificar, se disuelve el Clonex, agitando nuevamente. La cantidad de Clonex se sitúa en torno a 1-2 mm/l.

Se vierten unos 50 ml de la solución sobre los botes  y se tapan con su tapadera. Se deja enfriar.

Se cubre la tapadera con film transparente y se guarda en la nevera o en un lugar fresco.

HELLOMOTOPara la preparación del medio en casa, se puede usar una olla de cocina.

También se pueden usar cubiteras, vasos de plástico, y muchos otros contenedores.

La principal ventaja de usar botes con tapadera es que el esqueje no tendrá que ser colocado en ningún invernadero. El interior del bote ya mantiene las condiciones de humedad óptimas. Otra opción, si no se dispone de tapadera, es tapar solo con el film transparente.

En el caso de no usar botes, los esquejes deberán ser emplazados en un invernadero con una humedad relativa elevada (en torno al 80-90%).

Los esquejes se preparan como si se fuesen a poner en tierra, con la salvedad de que no es necesario añadir clonex. Se introduce el último nudo en el gel, se vuelve a tapar el bote y  se cubre con papel de aluminio o film transparente.

Una vez que los esquejes han desarrollado raíces, se procede a pasarlos a tierra.

Es importante que, si no conlleva riesgo para las raíces, se retire el gel antes de pasar a tierra.

Si se quiere usar el medio resultante para germinar semillas, bastará con verter una parte de la disolución en una cubitera, en un vaso de plástico o en cualquier otro tipo de recipiente. Una vez solidificado el medio, se puede proceder a su vaciado a modo de flan. Dicho flan puede ser cortado en varios cubitos del tamaño que se desee. Las semillas son insertadas en el interior del medio con la ayuda de una aguja.

Otra de sus aplicaciones podría ser la conservación de clones en el frigorífico durante varias semanas.

BIBLIOGRAFÍA

–  LOS ORIGENES DE LA CIVILIZACIÓN. V. Gordon Childe. Breviarios. Fondo de Cultura Económica. México. 1954.

– FUNDAMENTOS DE FISIOLOGÍA VEGETAL. Joaquín Azcón-Bieto, Manuel Talón. McGraw-Hill Interamericana. Barcelona. 2003.

– CULTIVO IN VITRO DE LAS PLANTAS SUPERIORES. R.L.M. Pierik. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid. 1990.

Si tienes cualquier duda sobre cultivo recuerda que siempre puedes hacerla llegar a nuestro correo info@airambarcelona.com y también puedes encontrarnos en nuestra Fan Page de Facebooky Twitter.

Ahora ya lo sabes… ¡a cultivar!

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